Mario Martone widmete sich dem Musiktheater erstmals 1988 mit Oedipus Rex in Gibellina, gefolgt von Lorenzo Ferreros Charlotte Corday am Teatro dell’Opera di Roma (1989). Mit Così fan tutte am Teatro di San Carlo in Neapel (1999) wurde die Oper neben Theater und Film zu einem festen Bestandteil seiner künstlerischen Arbeit. Claudio Abbado leitete diese Produktion bei seiner ersten Auseinandersetzung mit Mozarts Oper. Mario Martone vervollständigte die Da-Ponte-Trilogie anschließend mit Don Giovanni (Opernpreis 2002) und Le nozze di Figaro. Am Rossini Opera Festival entstanden Matilde di Shabran (Abbiati-Preis 2004), Torvaldo e Dorliska und Aureliano in Palmira (Internationaler Opernpreis 2014). Im modernen und zeitgenössischen Repertoire inszenierte er u. a. Lulu, Antigone von Silvia Colasanti, Il combattimento di Tancredi e Clorinda von Battistelli, Sancta Susanna, The Curlew River, The Prodigal Son sowie Henzes The Bassarids (Abbiati 2015).
Ein Schwerpunkt gilt Verdi: u. a. Un ballo in maschera am Royal Ballet & Opera in London, Falstaff und Macbeth an der Opéra national de Paris, Otello in Tokio sowie die Produktionen am Teatro alla Scala di Milano (Oberto, Luisa Miller, Rigoletto). An der Scala inszenierte er zudem Cavalleria rusticana/Pagliacci, drei Opern von Giordano – La cena delle beffe, Fedora und Andrea Chénier (Premiere 2017) – sowie Mussorgskys Chovanščina (Abbiati 2019) und Tschaikowskys Eugen Onegin. Während der Lockdowns 2020/21 entstanden für die Oper in Rom und Rai Cultura Filmfassungen von Il barbiere di Siviglia, La traviata sowie 2022 La Bohème. 2021 eröffnete er die Saison am Teatro di San Carlo mit einer Neuproduktion von Otello. Für die Ausstellung Fantasmagoria Callas schuf er den Kurzfilm Hommage à Maria Callas.